PG Deryabin, AN Chistyakov, GA Presnova, EI Isaeva, DK Lvov
The D.I.Ivanovsky Institute of Virology, Moscow, Russia
OOO “Beryozovy mir “Moscow, Russia

К числу наиболее опасных и повсеместно распространенных инфекционных заболеваний вирусной природы относят вирусный гепатит С Более 3% населения мира инфицировано ВГС, который был открыт относительно недавно, в 1989 году. С его открытием началось интенсивное изучение этой разновидности гепатита, являющейся основной причиной развития хронических диффузных заболеваний печени, цирроза и первичного рака печени. Одной из важных особенностей ВГС является способность к длительному персистированию в организме, что обуславливает высокий уровень хронизации инфекции (50-80% случаев). Феномен персистенции ВГС и высокий уровень “мутаций”, приводящих к возникновению иммунологически различающихся вариантов ВГС- «квазивидов», избегающих иммунного надзора – взаимосвязанные события, происходящие в инфицированном организме. Необходимость изыскания и создания новых средств терапии вирусного гепатита С, связана с низкой терапевтической эффективностью существующих препаратов (a-интерферон и a-интерферон в комбиниции с рибавирином), а также с высоким уровнем заболеваемости вирусным гепатитом С. Кроме того, поиск новых препаратов необходим из-за высокой стоимости используемых на практике лечебных препаратов и побочных эффектов таких как развитие анемии, нейтропении, лейкопении, диспептических явлений.

ЛЕЧЕБНЫЙ ПРЕПАРАТ БЕТУЛИН

Данная работа посвящена оценке противовирусной активности нового продукта производства ООО «Березовый мир» – экстракта коры березы, содержащего бетулинол (бетулин), на модели инфекции, вызванной вирусом гепатита С (ВГС) в организме ВГС инфицированных мышей.

Задачей настоящего исследования является проверка продукта экстракта из коры березы как противовирусного препарата, для лечения гепатита С. Природное происхождение действующих веществ экстракта коры березы, решает целый ряд негативных проблем, возникающих при применении химиопрепаратов. Основным действующим веществом экстракта является тритерпеновый спирт – бетулинол (бетулин).

В 1788 году русский академик Ловиц Т.Е., химик и фармацевт, путём сублимации выделил из бересты белое вещество, названное позднее «бетулин». Его молекулярная формула (C30H50O2) установлена в двадцатые годы прошлого века, а структурная – в начале 1950-х годов. Бетулин – пентациклический тритерпеновый спирт ряда лупана.

Бетулин является защитным веществом самой березы и находится в основном в верхнем слое коры, окрашивая ее в белый цвет. Большое число исследований посвящено гепатопротекторной активности бетулина. Возможность применения производных бетулина исследовалась в отношении гепатита на моделях гепатита не вирусного происхождения, вызванного Cll₄, тетрациклином и ацетоном. (О.Б. Флехтер “Синтез эфиров тритерпеноидов группы лупана и их гепатопротекторная активность”, Биоорганическая химия, 2000, том 26, №3, стр. 215-223).

В результате проведенных исследований было обнаружено, что экстракт коры березы обладает антивирусными свойствами. Этот эффект был продемонстрирован на модели экспериментальной инфекции, вызванной вирусом гепатита С человека (генотип 1b) в культурах клеток и на модели экспериментальной инфекции, вызванной ВГС у мышей.

МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВГС ИНФЕКЦИЯ ПОЗВОЛЯЮТ ПРОВОДИТЬ СКРИНИНГ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ.

Испытания, скрининг новых препаратов, которые могут быть активны в отношении вирусного гепатита С, стали возможными благодаря впервые полученным нами экспериментальных моделей инфекции, вызванной ВГС в культурах клеток на уровне организма лабораторных животных. В результате полученыострая и хроническая инфекции, вызванные ВГС в культурах клеток. Выделены и идентифицированы высокопродуктивные для культур клеток различного происхождения высокопродуктивные варианты ВГС. Показана возможность моделирования инфекции, вызванной разными вариантами (генотипами) ВГС не только в культурах клеток, но и в организме лабораторных животных (мышей). Получена острая и хроническая инфекция, вызванная ВГС в культурах клеток, чувствительных к репродукции флавивирусов. Таким образом, появилась уникальная возможность для оценки противовирусной активности препаратов на экспериментальной модели, вызванной ВГС в культурах клеток. Показано, что изолированные варианты ВГС способны вызвать хроническую инфекцию лабораторных мышей и кроликов, что позволило использовать этих животных для оценки противовирусной активности препаратов.

ОЦЕНКА ПРОТИВОВИРСУНОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ БЕТУЛИН В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК, ИНФИЦИРОВАННЫХ ВГС.

В работе использовали цитопатогенный штамм вируса гепатита С (ВГС), относящийся к генотипу 1b, а также культуры клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ). Препарат фирмы «Березовый мир»: бетулин, в виде суспензии на физиологическом растворе с 1% твина 80 , разводили на питательной среде 199 и по 30 мкл каждого из разведений препарата вносили в лунку с культурами клеток СПЭВ. Через 4-6 дней определяли цитотоксически свойства препарата. Показано, что препараты в разведениях от 1:10 и более не обладают цитотоксическими свойствами, что позволило использовать ряд концентраций препарата для изучения противовирусной активности. С этой целью препарат в различных концентрациях вносили в культуры клеток СПЭВ за 24 часа до заражения клеток ВГС, в момент заражения и через 24 часа после заражения вирусом клеток. На 4-й день после заражения клеток отбирали пробы питательной среды и определяли инфекционную активность вируса для культур клеток СПЭВ. Результаты учитывали на 7-й день, когда в культурах клеток, зараженных ВГС без препарата, развивались максимальные явления вирусиндуцированной гибели клеток, а контрольные незараженные культуры клеток СПЭВ оставались здоровыми.

Из таблицы 1 видно, что максимальная активность препарата Бетулин была зарегистрирована при внесении его в разведении 1:20 в культуры клеток СПЭВ сразу же после заражения клеток ВГС. В этом случае титры ВГС в пробах среды, отобранных на 4-й день после заражения вирусом, снижались на 4,2 lg. Бетулин не оказывал заметного влияния на снижение инфекционных свойств ВГС, когда препарат вносили через 24 часа после заражения клеток вирусом. Следует лишь отметить, что препарат Бетулин в этих условиях не приводил к стимуляции вируспродуцирующей активности клеток. Наиболее стабильным проявлением антивирусных свойств препарата Бетулин было отмечено при его профилактическом применении, т.е. за 24 часа до заражения клеток ВГС.

Табл.1

ПРОТИВОВИРУСНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПРЕПАРАТА БЕТУЛИН 98 НА ИНФЕКЦИЮ, ВЫЗВАННУЮ ВИРУСОМ ГЕПАТИТА С В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК СПЭВ.

Титры вируса, содержащиеся в пробах среды, отобранной из зараженных культур клеток СПЭВ в этом случае стабильно снижались под влиянием разных разведений вносимого препарата на 2,1 – 2,9 lg ТЦД50 .

ОЦЕНКА ПРОТИВОВИРСУНОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ БЕТУЛИН НА УРОВНЕ ОРГАНИЗМА ВГС ИНФИЦИРОВАННЫХ МЫШЕЙ.

В опытах использовали белых беспородных мышей, которых заражали внутрибрюшинным способом ВГС, а через 10 дней после заражения ежедневно в течение 4 дней перорально вводили препарат Бетулин в дозах 50, 100 и 150 мг на кг веса животных. Через 3 дня после последнего введения экстракта исследовали кровь, печень и головной мозг мышей на наличие инфекционного вируса гепатита С и его антигенов. Как видно из табл.2, у животных, получавших препарат в дозе 50 мг/кг, была отмечена заметная тенденция к снижению титров гемагглютинина ВГС, а инфекционные титры ВГС в сыворотке крови падали почти в 1000 раз — на 2,6 lg (средние данные). Значительное снижение антигенной и инфекционной активностей ВГС в сыворотке крови отмечали в группе животных, получавших ежедневно экстракт в дозе 100 мг/кг. В этом случае титры инфекционной активности ВГС падали более чем в 1000 раз (на 3,4 lg) и более чем в 2 раза снижалась антигенная активность ВГС в пробах сыворотки крови мышей. В меньшей степени препарат проявлял активность в случае использования его в дозе 150 мг/кг. Снижалась антигенная активность вируса, и почти в 100 раз уменьшалась концентрация вируса (на 1,8 lg).

Близкие результаты, свидетельствующие об эффективности экстракта коры березы, были получены при изучении тканей печени от всех групп животных (табл 2). В частности показано, что максимальное снижение антигенов ВГС и его инфекционной активности наблюдали в случае использования экстракта в разовой дозе 50 и 100 мг/кг при 4-кратном введении экстракта. Показано также, что антигенная активность ВГС при этом снижалась в 2 и более раз и до 100 раз отмечали снижение инфекционной активности ВГС в тканях печени. Сокращались и размеры печени у ВГС инфицированных мышей, получавших экстракт.

Наибольшие титры ВГС (до 7,0 lg ТЦД50 / 20 мкл) наблюдали в тканях головного мозга ВГС инфицированных мышей (табл.1в). Однако и в этом случае у мышей, получавших экстракт в дозах 50 и 100 мг/кг, наблюдали 100-кратное и большее снижение титров инфекционной активности ВГС. При этом снижение антигена ВГС отмечали во всех группах животных, получавших экстракт. В группе мышей, получавших экстракт в дозе 150 мг/кг, отмечена тенденция к увеличению титров инфекционной активности ВГС в головном мозге.

Табл.2

Противовирусная активность экстракта коры березы, содержащего бетулин при ВГС инфекции мышей на 17-й день после заражения и на 3-й день после 4-го введения препарата.

1) РГА — реакция гемагглютинации.

Таким образом, данные, полученные при изучении органов и тканей мышей на 17 день после инфекции ВГС и 3-й день после 4-кратного применения экстракта коры березы, свидетельствуют о высокой противовирусной активности экстракта. Показано, что пероральное введение экстракта коры березы мышам приводит к снижению инфекционной и антигенной активностей ВГС во всех исследованных органах и тканях животных, в том числе, и в головном мозге зараженных животных.

Для изучения профилактической активности препарата Бетулин на мышах препарат на физиологическом растворе, содержащем 1% Твин80, в дозах 50 мг, 100 мг и 150 мг на 1 кг веса вводили разным группам мышей перорально в течение 4 дней. Через 2 дня после 4-го введения мышей заражали внутрибрюшинно вирусом гепатита С. Три группы мышей служили в качестве контролей: группа животных, инфицированных внутрибрюшинно ВГС, но не получавших препарат, группа незараженных животных, и группа незараженных животных, которым препарат в дозе 150 мг на 1 кг веса вводили в течение 4-х дней. Через неделю после заражения животных вскрывали, извлекали печень, головной мозг, забирали кровь.

Как видно из данных таблицы 3, профилактическое применение препарата Бетулин, как правило, приводит к снижению показателей инфекции, вызванных ВГС в организме ВГС инфицированных мышей. В частности, исследование проб сывороток крови животных дало возможность показать, что Бетулин в дозе 50 мг на1 кг веса приводит к существенному (18-кратному) снижению гемагглютинирующей активности вируса , а инфекционные титры ВГС в сыворотке крови животных в среднем снижались на 2,4 lg. Применение препарата в дозе 100 мг на 1кг веса животных приводило к 13 –кратному снижению содержания антигенов ВГС в крови, инфекционные титры ВГШС снижались при этом почти в 2 раза.

Аналогичные данные были получены и при анализе ткани печени, взятых от разных групп животных:. Изучение тканей головного мозга ВГС инфицированных мышей позволило получить данные, свидетельствующие о том, что профилактическое применение препарата приводило почти к 100-кратному снижению инфекционной активности ВГС и к 4-кратному снижению титра антигенов ВГС. Несколько в меньшей степени препарат действовал, когда ежедневная доза его составляла 100 мг на 1кг веса. Результаты рассматривались как негативными при профилактическом применении препарата в дозе 150 мг на 1 кг веса.

Табл.3

Таким образом, получены данные, свидетельствующие о том, что препарат Бетулин обладает способностью подавлять репродукция вируса гепатита С как в культурах клеток, инфицированных ВГС, так и на уровне организма лабораторных животных (мышей) при терапевтической и профилактической схемах применения препарата. Эти данные открывают перспективу клинических испытаний данного препарата при ВГС инфекции у людей.

Результаты исследований, полученные при профилактическом применении препарата бетулин у мышей, инфицированных вирусом гепатита