ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА КОРЫ BETULA НА СПОНТАННЫЙ И ИНДУЦИРОВАН-НЫЙ МУТАГЕНЕЗ У МЫШЕЙ


Жанатаев А.К., Г.А. Преснова, А.Н. Чистяков, А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин

ГУ НИИ фармакологии РАМН, Москва, Россия

Исследование выполнено методом учета клеток с хромосомными повреждениями у мышей C57Bl/6. Бересты экстракт сухой (БЭС) вводили перорально в дозах 50, 150 и 450 и 1500 мг/кг, мутагены - диоксидин (200 мг/кг) и циклофосфамид (20 мг/кг), внутрибрюшинно.

БЭС (150 и 1500мг/кг) не обладал цитогенетической активностью, а в дозах 50, 150 и 450 мг/кг значимо уменьшал цитогенетический эффект мутагенов при различных режимах введения (однократно совместно, пять дней предварительно, пять дней совместно). Полученные данные доказывают антимутагенные свойства БЭС.

Ключевые слова: экстракт бересты сухой, антимутагены, мыши.

Электронный адрес: pharmacol@yandex.ru

Береста - кора березы (Betula) - богатейший источник тритерпеноидов группы лупана; бетулина, лупеола и бетулиновой кислоты. Эти соединения обладают противовоспалительными, радиопротекторными, гепатопротекторными, противовирусными, противоопухолевыми, иммунномодулирующими и антиоксидантными свойствами [1-5].

Соединения, обладающие антиоксидантной и иммуномодулирующей активностями, часто проявляют антимутагенные свойства [6]. Среди тритерпеноидов подобная активность была выявлена у лупеола и бетулиновой кислоты [7,8].

Недавно компанией «Берёзовый мир» был освоен способ получения экстракта бересты в промышленных масштабах с содержанием бетулина не менее 70 % (БЭС) и показано наличие у него широкого спектра биологических свойств [9].

Изучение активности БЭС в генотоксикологическом исследовании было целесообразно как с точки зрения изучения антимутагенных свойств в экспериментах на млекопитающих, так и в рамках доклинической оценки безопасности применения. В этой связи, целью настоящего исследования явилось изучение влияния БЭС на спонтанный и индуцированный диоксидином и циклофосфамидом мутагенез у мышей.


МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Метод учета хромосомных аберраций рекомендован для оценки мутагенной и антимутагенной активности химических соединений различного происхождения[10,11].

Эксперименты проводили на самцах мышей линии С57Bl/6 массой 22-25 г в возрасте 8-12 недель. Животных содержали в стандартных условиях вивария ГУ НИИ фармакологии РАМН при 12-часовом световом режиме и свободном доступе к воде и сбалансированному брикетированному комбикорму.

В исследовании использовали БЭС производства ООО «Березовый Мир» (Регистрационный номер СЭЗ № 77.99.03.936.Б.000201.02.04).

БЭС вводили в виде суспензии с детергентом Twin-80 (Sigma, США) внутрижелудочно в дозах 50, 150, 450 и 1500 мг/кг. Контрольные животные получали эквивалентный объем дистиллированной воды, содержащей детергент.

В качестве индукторов мутагенеза использовали антибактериальный препарат широкого спектра действия диоксидин (1,4-Ди-N-окись 2,3-бис-(оксиметил) хиноксалина), производства ООО "Фармакон" (Россия) в дозе 200 мг/кг и цитостатический, противоопухолевый препарат циклофосфамид (N`-бис-(b-Хлорэтил)-N`-О-триметиловый эфир диамида фосфорной кислоты), производства ООО «Компания Деко» (Россия) из расчета 20 мг/кг. Оба мутагена вводили внутрибрюшинно.

Оценка мутагенной активности БЭС (150 и 1500 мг/кг, перорально) на мышах была выполнена в соответствии с методическими рекомендациями Фармакологического комитета МЗ РФ [11].

Эксперименты по оценке мутаген-модифицирующей активности БЭС проводили в трех вариантах. В первом БЭС вводили однократно одновременно с мутагеном (острый эксперимент). Во втором, БЭС вводили ежедневно в течение пяти дней. Последнее введение БЭС сочетали с инъекцией мутагена (предобработка). В третьем – БЭС и мутаген вводили однократно, ежедневно в течение пяти дней (совместное введение). В последнем случае забой животных проводили через 6 часов после последней инъекции, в остальных случаях через 24 часа.

Цитогенетические препараты костного мозга бедренных костей готовили стандартным суховоздушным методом [12]. При цитогенетическом анализе учитывали клетки с ахроматическими пробелами (гепами), одиночными и парными фрагментами хромосом и обменами различного типа. В отдельную категорию - клетки с множественными повреждениями - выделяли метафазы, имеющие более пяти хромосомных повреждений. Статистическую обработку (j-критерий) проводили путем сравнения долей клеток с хромосомными повреждениями в контрольной и экспериментальной группах. В каждом варианте эксперимента использовали 4-5 животных, от каждого животного анализировали по 100 метафаз.


РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Цитогенетический анализ клеток костного мозга, выполненный после однократного и пятидневного введения БЭС (150 мг/кг) самцам и самкам мышей и после его однократного введения самцам в дозе 1500 мг/кг, не выявил мутагенной активности экстракта. Количества клеток с хромосомными аберрациями в экспериментальных сериях исследования практически не отличались от значений, установленных у контрольных животных.

В таблице №1 представлены результаты, характеризующие влияние экстракта бересты (БЭС) на цитогенетические эффекты диоксидина (ДН) и циклофосфамида (ЦФ), применяемых из расчета 200 и 20 мг/кг, соответственно.

Однократное введение ДН в дозе 200 мг/кг привело к увеличению клеток с хромосомными аберрациями до значения 10.2±1.4%, что статистически достоверно выше значения контроля (1.6±0.6%).

После введения комбинации БЭС в дозе 50 мг/кг и ДН зафиксировано 4.8±1.0% аберрантных метафаз. Полученное значение статистически достоверно отличается от значения позитивного контроля и соответствует 53% снижению эффекта ДН. При применении БЭС в дозе 150 мг/кг антимутагенный эффект последнего возрос и составил 61%: зарегистрировано 4.0±0.9% поврежденных метафаз. Дальнейшее увеличение дозы БЭС до 450 мг/кг привело к снижению антимутагенного эффекта, который составил 33%.

Антимутагенные эффекты БЭС были далее подтверждены при использовании в качестве модельного мутагена ЦФ (таблица №1).

При применении БЭС в дозах 50 и 150 мг/кг зарегистрирован одинаковый антимутагенный эффект: снижение повреждающего действия мутагена в обоих случаях составило 60% (уровень хромосомных аберраций 3.5±0.9% против 8.8±1.4% в позитивном контроле). При дальнейшем увеличении БЭС до 450 мг/кг антимутагенный эффект не выявлен: полученный показатель – 6.4±1.1% аберрантных метафаз не отличался статистически достоверно от значения позитивного контроля.

В следующей серии экспериментов, результаты которых представлены в таблице №2, исследовалось влияние 5-дневной предобработки БЭС на проявление мутагенных эффектов ДН.

Антимутагенные эффекты БЭС по сравнению с однократным введением возросли. При использовании в дозе 50 мг/кг наблюдалось 49% снижение повреждающего действия мутагена. С увеличением вводимой дозы до 150 мг/кг защитный эффект БЭС возрос и составил 63%. При применении в дозе 450 мг/кг зарегистрирован максимальный антимутагенный эффект – полное подавление повреждающего действия мутагена: полученный показатель- 2.6±0.7% аберрантных метафаз не отличается статистически от значения спонтанного уровня мутирования (1.6±0.6%).

Антимутагенные эффекты БЭС при 5-ти дневной предобработке, по сравнению с однократным введением, возросли и при использовании в качестве мутагена ЦФ (таблица №2).

После введения ЦФ животным, обработанным БЭС в дозе 50 мг/кг, зарегистрировано 5.5±1.1% аберрантных метафаз, что соответствует 54% снижению цитогенетических эффектов мутагена. С увеличением дозы антимутагенный эффект БЭС возрос и составил 65%: 4.2±0.9% аберрантных метафаз против 12.0±1.5% в позитивном контроле. В отличие от однократного введения, БЭС проявил антимутагенный эффект и в дозе 450 мг/кг. Полученный показатель, 4.4±0.9% поврежденных клеток соответствовал 63% редукции эффектов мутагена.

В следующей серии экспериментов исследовали влияние БЭС на мутагенные эффекты ДН и ЦФ в условиях 5-ти дневного совместного введения. Полученные результаты представлены в таблице №3.

После пятидневной обработки животных ДН в дозе 200 мг/кг хромосомные аберрации зарегистрированы в 11.6±1.4% исследованных метафаз. После совместного применения БЭС в дозе 50 мг/кг и ДН выявлено 6.6±1.2% поврежденных клеток, что соответствует 43% снижению эффектов мутагена. Результат, полученный после совместного применения мутагена и БЭС в дозах 150 и 450 мг/кг составил, соответственно, 4.8±1.1% и 5.8±1.0% аберрантных метафаз. Попарное сопоставление зарегистрированных результатов с данными позитивного контроля выявило статистически достоверные различия, при этом в дозе 150 мг/кг антимутагенный эффект составил 59%, а дозе 450 мг/кг – 50%.

При использовании ЦФ антимутагенный эффект БЭС выявлен во всех исследованных дозах. После совместного введения БЭС в дозе 50 мг/кг и мутагена, зарегистрировано 3.8±0.7% аберрантных метафаз, что соответствует 54% снижению эффектов ЦФ. При применении БЭС в более высоких дозах 150 и 450 мг/кг антимутагенные последнего оказались сходными. Полученные показатели 5.0±1.0 и 5.2±1.0% аберрантных метафаз, соответствовали 40 и 38% редукции повреждающего действия мутагена.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о наличии у БЭС антимутагенной активности. Данное наблюдение согласуется с данными, указывающими на антимутагенные свойства бетулиновой кислоты и лупеола [7,8].

По совокупности полученных данных антимутагенные эффекты БЭС наиболее выражены в условиях предварительного многодневного введения и при его использовании в дозе 150 мг/кг. Сравнительный анализ антимутагенного действия по отношению повреждающему действию использованных мутагенов показывает, что БЭС наиболее эффективен в случае применения в качестве модельного мутагена ДН.

Экстракты бересты, а также бетулин (74 % в изучаемом образце), лупеол, бетулиновая кислота, входящие в состав БЭС, обладают выраженной антиоксидантной активностью [13]. В свою очередь, ДН, эффект которого эффективно подавляется БЭС, является мутагеном прооксидантного типа действия [6]. Следовательно, антимутагенное действие БЭС может быть объяснено его способностью к подавлению свободно-радикального окисления.

В реализации цитогенетического эффекта ЦФ принимают участие продукты ПОЛ [14], поэтому подавление эффекта этого мутагена также возможно объяснить наличием у БЭС антиоксидантной активности. Вместе с тем, ЦФ является непрямым мутагеном, основной механизм действия которого связан со способностью его метаболитов, главным образом акролеина, алкилировать молекулу ДНК [15]. Это позволяет предполагать, что защитное действие БЭС может быть также связано с подавлением активности цитохромов семейства Р450, участвующих в метаболизме ЦФ.

Можно полагать, что выше указанные механизмы не исчерпывают возможных путей реализации антимутагенного эффекта БЭС, поскольку в предварительных экспериментах была показана способность БЭС индуцировать продукцию интерферонов, которые, как известно, позитивно влияют на процессы репарации ДНК [6].

Предшествующий анализ [6] показал, что антимутагенный эффект соединений природного происхождения и их комплексов практически не превышает 50 %. При этом, наряду с позитивным антимутагенным эффектом они часто проявляют нежелательное комутагенное действие. БЭС выгодно отличается отсутствием комутагенных эффектов и эффективностью антимутагенного действия. Его защитный эффект в условиях однократного и предварительного введения в подавляющем большинстве случаев составляет не менее 60 %.

Таким образом, совокупность результатов, полученных в экспериментах на млекопитающих, позволяют заключить, что БЭС характеризуется выраженной антимутагенной активностью и не обладает нежелательными мутагенными и комутагенными свойствами.


Список литературы

1. Василенко Ю.К., Семенченко В.Ф., Фролова Л.М. и др. Фармакологические свойства тритерпеноидов коры березы// Эксперим. и клин. фармакология, 1993, т.56, №4, 53-55.

2. Recio M.C., Giner R.M. et al. Investigetions on the steroidal antiflammatory activity of triterpenoids from Diospyros leucomelas// Planta Medica, 1995, 61(1), 9-12.

3. Карачурина Л.Т., Сапожников Т.А., Зарудий Ф.С. и др. Исследование некоторых фармакологических свойств бисгемифталата бетулина// Эксперимент. и клин. фармакол., 2003, т. 66, №4, 56-59.

4. Akihisa T., Ogihara J., Kato J. Inhibitory effects of triterpenoids and sterols on human immunodeficiency virus-1 reverse transcriptase// Lipids, 2001, 36(5), 507-512.

5. Han S., Li Z. Antitumor effect of the extract of birch bark and its influence to the immune function// Zhong Yao Cai., 2000, 23(6), 343-345.

6. Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Мутагены: скрининг и фармакологическая профилактика воздействий // Москва, «Медицина», 1998, 326 с.

7. Salti G.I., Kichina J.V., Das Gupta T.K. et. al. Betulinic acid reduces ultraviolet-C-induced DNA breakage in congenital melanocytic naeval cells: evidence for a potential role as a chemopreventive agent// Melanoma Res, Apr 2001; 11(2): 99-104.

8. Guevara A.P., Amor E. and Russell G. Antimutagens from Plumeria acuminata Ait// Mutat. Res., Dec 1996; 361(2-3): 67-72.

9. «Сырье для производства биологически активных добавок к пище «Бересты экстракт сухой». Регистрационный номер СЭЗ 77.99.03.936.Б. 000201.02.04 от 16 февраля 2004 года.

10. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ./ Москва, 2000 г.

11. Бочков Н.П., Дурнев А.Д., Журков В.С. и др. Система поиска и изучения соединений с антимутагенными свойствами. (Методические рекомендации).// Хим.-фарм. жур., 1992, № 9-10, с. 42- 46.

12. Preston R.J., Dean B.J., Galloway S. at al. Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells// Mutat. Res., 1987, 189, 157-165.

13. Kahkonen M.P., Hopia A.I., Vuorela H.J., Rauha J.P., Pihlaja K., Kujala T.S. and Heinonen M. Antioxidant activity of plant extracts containing phenolic compounds// J Agric Food Chem, Oct 1999; 47(10): 3954-62.

14. Kanekal S., Kehrer J.P. Metabolism of cyclophosphamide by lypoxygenases.// Drug. Metab. Dispos.,1994, 22, 74-78.

15. Anderson D., Bishop J.B., Garner R.C. et al. Cyclophosphamide: review of its mutagenicity for an assessment of potential germ cell risk.// Mutat. Res., 1995, 330, 115-181.

16. Yamashita K., Lu H., et. al. Effects of three triterpenoids, lupeol, betulin and betulinic acid on the stimulus-indused superoxide generation and tyrosyl phosphorylation of proteins in human neutrophils// Clinica Chimica Acta, 2000, 325(1-2), 91-96.

Вернуться