BIRCH WORLD

ФИТОПРЕПАРАТЫ С ДОКАЗАНОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ И БЕЗОПАСНОСТЬЮ

Интерферониндуцирующие свойства сухого экстракта бересты и его влияние на экспериментальную инфекцию, вызванную вирусом гепатита С

УДК 615.322.03:616.36-002-022:578.891J076.9

Н. Н. Носик, П. Г. Дерябин, Е. И. Исаева, Н. Г. Копдрашина, Л. А. Лаврухина, А. Н. Иноземцев,

Г. А. Преснова, Т. В. Тополева

Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, ООО «Березовый мир», Москва

Проведены исследования по изучению интерферониндуцирующей активности бересты экстракта сухого, содержащего бетулин, и его влияния на инфекцию, вызванную вирусом гепатита С (ВГС), в клетках. Все образцы препарата индуцировали высокий уровень синтеза интерферона как при внутрибрюшинном, так и при пероральном пути введения. Дозовая зависимость уровня синтеза интерферона указывает на пря­мую связь препарата с индукцией интерферона. Получены убедительные данные о способности препара­та снижать антигенную и инфекционную активность ВГС как в опытах in vitro, так и при инфекции, вызван­ной ВГС у мышей. Обнаружен профилактический эффект препарата при инфекции ВГС в культуре клеток и в организме ВГС-инфицированных мышей.

Ключевые слова: вирус гепатита С, инфекция, культура клеток, мыши, сухой экстракт бересты, индукция интерферона, противовирусное действие

The interferon-inducing activity of dry birch bark extract containing betulin and its effect on hepatitis С virus (HCV)-induced infection were studied in the cultured cells. All samples of the extract induced increased interferon (IFN) production when it was orally and intraperitoneally administered. The dose-dependence of the production of IFN showed a direct relation of the extract to interferon induction. There is strong evidence for that the extract can de­crease the antigenic and infective activity of HCV in both in vitro experiments and HCV-induced infection in mice. The preventive effect of the extract was found in both the HCV-infected cell cultures and the HCV-infected mice.

Key words: hepatitis С virus, infection, cell culture, mice, dry birch bark extract, interferon induction, antiviral effect

При очень ограниченном числе этиотропных противовирусных препаратов все большее внимание уделяется разработке и изучению средств, усили­вающих реакции неспецифического иммунитета. Новой и весьма перспективной группой препаратов для лечения вирусных инфекций, в том числе ви­русного гепатита С, являются индукторы интерфе­рона (ИФН), представляющие собой разнородную группу высоко- и низкомолекулярных природных и синтетических соединений, обладющих способно­стью индуцировать синтез ИФН. Как правило, эти препараты обладают антивирусной, антитумороген-ной и иммуномодулирующей активностью.

Вирус гепатита С (ВГС) относится к семейству Flaviviridae и является этиологическим агентом ге­патита С [5]. Острая ВГС-инфекция сопровожда­ется последующей персистирующей репликацией вируса примерно в 85—90% случаев. В результате расширяется спектр хронических заболеваний пе­чени, включая хронический гепатит, цирроз и ге-патоцеллюлярную карциному [5]. В настоящее вре­мя остро стоит вопрос поиска альтернативных пу­тей терапии ВГС-инфекции, поскольку почти единственным препаратом выбора для лечения ВГС-инфекции является а-ИФН [5].

С этой целью впервые в мире нами были созданы экспериментальные модели высокопродуктивной инфекции, вызванной ВГС, в культурах клеток и в организме животных. Из сывороток крови больных выделяли и идентифицировали цитопато-генные варианты ВГС, способные реплицироваться в организме мышей [1—4]. Тем самым была открыта перспектива проведения доклинических ис-пытаний антивирусного действия препаратов в отношении ВГС-инфекции. Производимый в на-стоящее время фирмой «Березовый мир» препарат растительного происхождения бересты экстракт сухой, содержащий тритерпеновые соединения, главным компонентом которых является пента-циклический тритерпеновый спирт ряда лупана бетулин с содержанием его в экстракте не менее 70%, обладает выраженными противовоспалительными и антитуморогенными свойствами [6—8]. Мы сделали предположение о способности экстракта индуцировать синтез ИФН, что требовало подтверждения, а также исследовали его воздействие на экспериментальную инфекцию, вызванную ВГС in vitro и in vivo.

Материалы и методы

Культура клеток. Использовали чувствительные к цитопатогенному действию ВГС культуры клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ). Культуры клеток СПЭВ выращивали на среде 199 с добавлением сы­воротки крупного рогатого скота (10%) и антибио­тиков. Для изучения противовирусной активности экстракта, содержащего бетулин, его в различных концентрациях вносили в культуры клеток СПЭВ за 24 ч до заражения клеток ВГС, в момент зара­жения и через 24 ч после заражения вирусом кле­ток. На 4-й день после заражения отбирали пробы среды и титровали вирус на культурах клеток СПЭВ. Результаты учитывали на 7-й день, когда в контрольных культурах развивались максимальные явления вирусиндуцированной гибели клеток, а пезаражспныс клетки СПЭВ оставались интактны-ми. Перевиваемую линию фибробластов мышей L929 получали из лаборатории культуры тканей Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН и использовали для определения уровня ИФН биологическим методом.

Животные. В исследовании использовали белых беспородных мышей массой 15—20 г, на которых изучали как интерферониндуцирующие свойства, так и после заражения ВГС антивирусное действие препарата. Материал, содержащий ВГС, вводили животным внутрибрюшинно. Часть животных со­ставили контрольную группу. На 9-й день после за­ражения мышам однократно перорально в течение 4 дней вводили суспензию экстракта, содержащего бетулин (50, 100 и 150 мг) на физиологическом рас­творе с 1% твина-80 в объеме 50 мкл. На 28-й день после заражения животных ВГС и на 11-й день по­сле последнего введения препарата животных вскрывали, извлекали печень, головной мозг, бра­ли кровь, готовили пробы гомогенатов органов и сыворотки крови для определения антигенов ВГС в реакции гемагглютинации (РГА) и инфекцион­ной активности ВГС. С целью изучения профилак­тического действия экстракта его в тех же дозах вводили разным группам мышей перорально в те­чение 4 дней. Через 2 дня после 4-го введения мы­шей заражали ВГС внутрибрюшинно. Через 7 дней после заражения от животных брали пробы тех же органов и тканей для исследования.

Вирусы. В исследованиях использовали цитопато-генный вариант ВГС, штамм D-1, выделенный из сы­воротки крови больной хроническим вирусным гепа­титом С, идентифицированный как генотип 1в ВГС [5]. Вирус энцефаломиокардита мышей использовали в качестве тест-вируса для определения титра ИФН.

Таблица I

Интерферониндуцирующая активность бересты экстракт сухого, содержащего бетулин, при внутрибрюшинном введении

Интерферониндуцирующая активность препарата БЕТУЛИН при внутрибрюшинном введении

Препарат Доза, мг\кг Уровень интерферона, ед\мл
5 часов 24 часа 48 часов
Бетулин 72% 25,0 8 64 32
50,0 8 256 256
Ридостин 7,5 128 256 256

Уровень ИФН в сыворотке крови мышей после перорального введения препарата с содержанием бетулина 72% (в) и 98% (б).

По осям ординат — титр ИФН (в ед/мл); по осям абсцисс — время (в ч). /-50 мг/кл; Я- 100 мг/кг; ///- 150 мг/кг

Препараты. С целью оценки противовирусного и интерферониндуцирующего действия исследова­ли 3 образца экстракта бересты: препарат № 1 (со­держание бетулина в экстракте 72% по данным вы­сокоэффективной жидкостной хроматографии — ВЭЖХ) вводили внутрибрюшинно; препарат № 22 (с содержанием бетулина 72% по ВЭЖХ) и препа­рат № 98 (с содержанием бетулина 98% по ВЭЖХ) — перорально. Исследуемые вещества растворяли в 1,0% растворе твина-80. Препарат № 1 вводили од­нократно внутрибрюшинно в течение 4 дней в до­зах 25,0 и 50,0 на 1 кг массы тела, препараты № 22 и 98 — однократно перорально в течение 4 дней в дозах 50,0, 100,0 и 150,0 мг/кг. Ридостин — индук­тор ИФН, представляющий собой дсРНК киллер-ного штамма дрожжей S. cerevisea, вводили одно­кратно внутрибрюшинно в дозе 7,5 мг/кг, исполь­зовали в качестве референс-индуктора ИФН.

Определение уровня ИФН. Уровень ИФН в пери­ферической крови определяли через 5, 24, 48 и 72 ч после однократного введения препарата. Опреде­ление уровня ИФН проводили биологическим ме­тодом по защите культуры клеток мышиных фиб-робластов L929 от 100 ЦПД50 вируса энцефаломио-кардита мышей. За титр ИФН принимали величи­ну, обратную конечному разведению сыворотки, при котором наблюдали защиту 50% клеток от ци-тодеструктивного действия 100 ЦПД50 тест-вируса.

Результаты и обсуждение

Введенный внутрибрюшинно препарат № 1 (со­держание бетулина 72%) индуцировал образование ИФН, который определялся в крови мышей через 24 ч после введения. Полученные результаты при­ведены в табл. 1. Отмечена дозовая зависимость уровня ИФН (64 ед/мл при дозе 25,0 мг/кг к 256 ед/мл при дозе 50,0 мг/кг).

Таблица 2

ПРОТИВОВИРУСНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПРЕПАРАТА БЕТУЛИН 98 НА ИНФЕКЦИЮ, ВЫЗВАННУЮ ВИРУСОМ ГЕПАТИТА С В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК СПЭВ.

Разведения препарата

Бетулин

Титры ВГС в пробах среды, отобранных на 4-й день после заражения культур клеток СПЭВ (lg ТЦД50
Препарат сразу после заражения Через 24 часа после заражения За 24 часа до заражения клеток
1:10 3,3 5.5. 2,5
1:20 1,3 5,5. 3,4
1:40 5,,0 4,6 3,2
1:80 4,8 5,0 3,3
Без препарата

(контроль)

5,5. 5,5 5,4

Введение препаратов экстракта бересты перо-рально также индуцировало синтез ИФН у мышей, уровень которого достигал своего пика к 48 ч после введения. При применении препарата № 22, со­держащего 72% бетулина, отмечали четкую дозо-вую зависимость уровня ИФН, максимальный титр которого, равный 640 ед/мл, наблюдали через 48 ч при дозе в 150,0 мг/кг (см. рисунок, а).

При применении препарата № 98 с содержани­ем 98% бетулина также наблюдали высокий уро­вень ИФН с максимумом через 48 ч. Однако четкой дозовой зависимости не отмечали, все исследуемые дозы препарата индуцировали одинаково высокий уровень синтеза ИФН (см. рисунок, б).

Полученные данные легли в основу проведения доклинических испытаний противовирусной актив­ности препарата, содержащего 98% бетулина, при ин­фекции, вызванной ВГС, в культурах клеток СПЭВ.

Как видно из данных табл. 2, максимальная актив­ность бетулина была зарегистрирована при внесении его в разведении 1:20 в культуру клеток СПЭВ сразу же после заражения клеток ВГС. В этом случае титры ВГС в пробах среды, отобранных на 4-й день после заражения вирусом, снижались на 4,2 lg. Препарат не оказывал заметного влияния на снижение титра ВГС, когда его вносили через 24 ч после заражения клеток вирусом. Наиболее стабильное проявление антиви­русных свойств бетулина было отмечено при его про­филактическом применении, т. е. за 24 ч до зараже­ния клеток ВГС. Титры вируса, содержащиеся в про­бах среды, отобранной из зараженных культур клеток СПЭВ, в этом случае стабильно снижались под влия­нием разных разведений вносимого препарата на 2,1-2,9 1ёТЦЦ50.

Представляло интерес изучить способность экс­тракта, содержащего бетулин, подавлять инфек­цию, вызванную ВГС, у мышей. В табл. 3 представ­лены данные этих исследований. В частности, был выявлен противовирусный эффект бересты экс­тракта сухого у ВГС-инфицированных мышей на 28-й день после заражения животных и на 11-й день после последнего введения препарата. Наи­больший эффект наблюдался в период, когда для лечения использовали дозу 50 мг/кг. В этом случае в сыворотке крови животных титры вируса снижа­лись в среднем на 1,9 lg, в печени — на 2,9 lg, в го­ловном мозге — на 2,4 lg. Четырехкратное введение препарата в дозе 100 мг приводило к менее суще­ственному уменьшению титра ВГС (см. табл. 3).

Данные об интерферониндуцирующем дейст­вии экстракта бересты, а также об антивирусных свойствах препарата при его профилактическом применении в опытах in vitro позволили провести исследования по оценке профилактического дейст­вия препарата при ВГС-инфекции у мышей.

Как видно из данных табл. 4, профилактическое применение препарата, как правило, приводило к снижению показателей инфекции, вызванной ВГС, в организме инфицированных мышей. В ча­стности, применение препарата в дозе 50 мг на 1 кг

Таблица № 3

Действие экстракта бересты, содержащего бетулин, на 28-й день после заражения животных ВГС и на 11-й день после последнего введения препарата.

Группы мышей, получавших бетулин в дозе (мг /кг в 50 мкл) Показатели ВГС инфекции
в сыворотке крови печень головной мозг
РГА lgТЦД50/20мкл РГА lgТЦД50/20мкл РГА lgТЦД50/20мкл
50 120 5,2± 0,4 160 3,2± 0,1 400 3,4± 1,0
100 80 5,5. ± 0,6 110 5,3± 0,1 240 4,3± 0,2
150 100 5,5 ± 0,5 200 6,5 ± 0,2 270 4,2 ± 0,1
Без препарата 200 7,1± 0,1 480 6,1± 0,1 480 5,8± 0,5
Незараженная мышь 25 0 50 0 50 0

Таблица № 4

Профилактическое действие экстракта бересты, содержащего бетулин, на ВГС инфекцию у мышей.

Группы мышей, получавших бетулин в дозе (мг /кг в 50 мкл) Показатели ВГС инфекции
в сыворотке крови печень головной мозг
РГА lgТЦД50/20мкл РГА lgТЦД50/20мкл РГА lgТЦД50/20мкл
50 1: 6,4 4,0± 0,2 1:220 3,0± 0,3 1:120 4,2± 0,1
100 1:8 4,5. ± 0,1 1:450 3,7± 0,3 1:280 4,8± 0
150 1:58 5,5 ± 0,1 1:600 4,5 ± 0,3 1:420 7,2 ± 0,1
Без препарата 1:109 6,4± 0,2 1:850 4,6± 0,6 1:480 6,15± 0,5
Незараженная мышь 0 0 1:50 0 1:50 0

массы тела привело к 18-кратному снижению ан-тигенной активности вируса, а инфекционные титра ВГС в сыворотке крови животных в среднем снижались на 2,4 lg. Профилактическое применение препарата в дозе 100 мг на 1 кг массы животных приводило к 13-кратному снижению содержания антигенов ВГС в крови, инфекционные титры ВГС снижались при этом почти в 10 раз. В случае использования дозы препарата, равной 150 мг на 1 кг массы тела, снижение показателей ВГС-инфекции у животных было незначительным.

Обнаружено снижение антигенной активности ВГС в печени мышей, получавших профилактиче­скую дозу препарата в дозе 50 и 100 мг на 1 кг массы. Различия в группе мышей, получавших 150 мг препа­рата па 1 кг массы, и у инфицированных ВГС живот­ных контрольной группы были несущественны. Не получено заметных различий в этих группах живот­ных и по показателю инфекционной активности ВГС в печени. Однако в группах мышей, получавших пре­парат в дозах 50 и 100 мг на 1 кг массы, инфекцион­ные титры вируса в среднем снижались на 1,6 и 0,9 lg.

Профилактическое применение (50 мг/кг) пре­парата бетулин приводило почти к 100-кратному снижению инфекционной активности ВГС и 4-кратному снижению титра антигенов ВГС в тка­нях головного мозга мышей. В меньшей степени препарат действовал, когда ежедневная доза его со­ставляла 100 мг на 1 кг массы. Профилактическое применение препарата в дозе 150 мг на 1 кг массы не давало положительного эффекта.

Таким образом, все образцы бересты экстракта сухого индуцировали высокий уровень синтеза ИФН как при внутрибрюшинном, так и при пероральном пути введения. Дозовая зависимость уров­ня ИФН указывает на прямую связь препарата с индукцией ИФН. Отсутствие четкой дозовой зави­симости при максимальном содержании бетулина в препарата может указывать на достижение насыщенности в соотношении индуктор—рецепторы ИФН. Важным свойством экстракта бересты явля­ется его способность индуцировать синтез ИФН при пероральном пути введения.

Получены убедительные данные о способности препарата снижать антигенную и инфекционную активность ВГС как в опытах in vitro в культурах клеток СПЭВ, инфицированных цитопатогенным вариантом ВГС, так и при инфекции, вызванной ВГС, у мышей массой 18—20 г. Обнаружен профи­лактический эффект препарата при ВГС-инфек­ции и в культурах клеток, и в организме инфици­рованных ВГС животных.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Дерябин П. Г., Исаева Е. И., Вязов С. О., Львов Д. К.Летальная
    инфекция новорожденных мышей, вызванная вирусом гепа­
    тита С // Вопр. вирусол. — 1997. — № 6. — С. 253—259.
  2. Дерябин П. Г., Исаева Е. И., Вязов С. О.и др. Хроническая
    инфекция культур клеток почки эмбрионов свиньи, вы­
    званная вирусом гепатита С // Вопр. вирусол.’— 1997. —
    № 6. — С. 259-263.
  3. Дерябин П. Г., Львов Д. К.Высокопродуктивный вариант,
    вируса гепатита С. Выделение, характеристика, идентифи­
    кация //Докл. АН Рос. Федерации. — 1998. — Т. 358, № 5.
    -С. 688-691.
  4. Дерябин П. Г., Львов Д. К., Исаева Е. И., Вязов С. О.Штамм
    Virus hepatitis С, Д-1 для приготовления диагностических
    и профилактических препаратов. Российский пат. на изо­
    бретение № 2130967, 1999 г. Приоритет от 07.10.97.
  5. Львов Д. К., Дерябин П. Г.Географическое распростране­
    ние вируса гепатита С и его генотипов // Вопр. вирусол.
    — 1997. -№ 5. -С. 196-199.
  6. ManezS., Recio M.С, GinerR. M., RiosJ. L. Effect of selected
    triterpenoids on chronic dermal inflammation // Eur. J. Phar­
    macol. — 1997. — Vol. 334, N 1. — P. 103-105.
  7. ZdzisiuskaВ., Rzeski W., Paduch R. et al. Differential effect of
    betulin and betulinic acid on cytokine production in human
    whole blood cell culture // Pol. J. Pharmacol. — 2003. —
    Vol. 55, N 20. — P. 235-238.
  8. Zuco V., Supino R., Righetti S.С et al. Selective cytotoxicity of
    betulinic acid on tumor cell lines, but not on normal cells //
    Cancer Lett. — 2002. — Vol. 175, N 1. — P. 17-25.

Поступила 10.08.04

Продукция компании “Березовый Мир”

Натуральные фитопрепараты на основе
Бетулиносодержащего экстракта бересты

100 % натуральный состав
сертификаты качества
27 патентов по использованию
медицинская доказательная эффективность
более 120 НИР
одобрено ассоциацией заслуженных врачей РФ
12 клинических испытаний

ООО «Берёзовый Мир»
119180 Москва, ул. Б. Полянка, д. 7/10, стр. 3
(Старомонетный пер. д.10, стр. 3)
Телефон: +7 800 234 87 79 (звонок по России бесплатный)
E-mail: info@birchworld.ru
с 09:00 до 18:00 по МСК в рабочие дни.

По вопросам сотрудничества:
E-mail: market@birchworld.ru

Мы рады Вас видеть и предоставить
необходимую консультацию

ООО «Берёзовый Мир»
119180 Москва, ул. Б. Полянка, д. 7/10, стр. 3
(Старомонетный пер. д.10, стр. 3)
Телефон: +7 800 234 87 79 (звонок по России бесплатный)
E-mail: info@birchworld.ru
с 09:00 до 18:00 по МСК в рабочие дни.

По вопросам сотрудничества:
E-mail: market@birchworld.ru

Мы рады Вас видеть и предоставить
необходимую консультацию