BIRCH WORLD

ФИТОПРЕПАРАТЫ С ДОКАЗАНОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ И БЕЗОПАСНОСТЬЮ

Влияние экстракта коры betula на спонтанный и индуцирован-ный мутагенез у мышей

Жанатаев А.К., Г.А. Преснова, А.Н. Чистяков, А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин

ГУ НИИ фармакологии РАМН, Москва, Россия

Исследование выполнено методом учета клеток с хромосомными повреждениями у мышей C57Bl/6. Бересты экстракт сухой (БЭС) вводили перорально в дозах 50, 150 и 450 и 1500 мг/кг, мутагены — диоксидин (200 мг/кг) и циклофосфамид (20 мг/кг), внутрибрюшинно.

БЭС (150 и 1500мг/кг) не обладал цитогенетической активностью, а в дозах 50, 150 и 450 мг/кг значимо уменьшал цитогенетический эффект мутагенов при различных режимах введения (однократно совместно, пять дней предварительно, пять дней совместно). Полученные данные доказывают антимутагенные свойства БЭС.

Ключевые слова: экстракт бересты сухой, антимутагены, мыши.

Электронный адрес: pharmacol@yandex.ru

Береста — кора березы (Betula) — богатейший источник тритерпеноидов группы лупана; бетулина, лупеола и бетулиновой кислоты. Эти соединения обладают противовоспалительными, радиопротекторными, гепатопротекторными, противовирусными, противоопухолевыми, иммунномодулирующими и антиоксидантными свойствами [1-5].

Соединения, обладающие антиоксидантной и иммуномодулирующей активностями, часто проявляют антимутагенные свойства [6]. Среди тритерпеноидов подобная активность была выявлена у лупеола и бетулиновой кислоты [7,8].

Недавно компанией «Берёзовый мир» был освоен способ получения экстракта бересты в промышленных масштабах с содержанием бетулина не менее 70 % (БЭС) и показано наличие у него широкого спектра биологических свойств [9].

Изучение активности БЭС в генотоксикологическом исследовании было целесообразно как с точки зрения изучения антимутагенных свойств в экспериментах на млекопитающих, так и в рамках доклинической оценки безопасности применения. В этой связи, целью настоящего исследования явилось изучение влияния БЭС на спонтанный и индуцированный диоксидином и циклофосфамидом мутагенез у мышей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Метод учета хромосомных аберраций рекомендован для оценки мутагенной и антимутагенной активности химических соединений различного происхождения[10,11].

Эксперименты проводили на самцах мышей линии С57Bl/6 массой 22-25 г в возрасте 8-12 недель. Животных содержали в стандартных условиях вивария ГУ НИИ фармакологии РАМН при 12-часовом световом режиме и свободном доступе к воде и сбалансированному брикетированному комбикорму.

В исследовании использовали БЭС производства ООО «Березовый Мир» (Регистрационный номер СЭЗ № 77.99.03.936.Б.000201.02.04).

БЭС вводили в виде суспензии с детергентом Twin-80 (Sigma, США) внутрижелудочно в дозах 50, 150, 450 и 1500 мг/кг. Контрольные животные получали эквивалентный объем дистиллированной воды, содержащей детергент.

В качестве индукторов мутагенеза использовали антибактериальный препарат широкого спектра действия диоксидин (1,4-Ди-N-окись 2,3-бис-(оксиметил) хиноксалина), производства ООО «Фармакон» (Россия) в дозе 200 мг/кг и цитостатический, противоопухолевый препарат циклофосфамид (N`-бис-(b-Хлорэтил)-N`-О-триметиловый эфир диамида фосфорной кислоты), производства ООО «Компания Деко» (Россия) из расчета 20 мг/кг. Оба мутагена вводили внутрибрюшинно.

Оценка мутагенной активности БЭС (150 и 1500 мг/кг, перорально) на мышах была выполнена в соответствии с методическими рекомендациями Фармакологического комитета МЗ РФ [11].

Эксперименты по оценке мутаген-модифицирующей активности БЭС проводили в трех вариантах. В первом БЭС вводили однократно одновременно с мутагеном (острый эксперимент). Во втором, БЭС вводили ежедневно в течение пяти дней. Последнее введение БЭС сочетали с инъекцией мутагена (предобработка). В третьем – БЭС и мутаген вводили однократно, ежедневно в течение пяти дней (совместное введение). В последнем случае забой животных проводили через 6 часов после последней инъекции, в остальных случаях через 24 часа.

Цитогенетические препараты костного мозга бедренных костей готовили стандартным суховоздушным методом [12]. При цитогенетическом анализе учитывали клетки с ахроматическими пробелами (гепами), одиночными и парными фрагментами хромосом и обменами различного типа. В отдельную категорию — клетки с множественными повреждениями — выделяли метафазы, имеющие более пяти хромосомных повреждений. Статистическую обработку (j-критерий) проводили путем сравнения долей клеток с хромосомными повреждениями в контрольной и экспериментальной группах. В каждом варианте эксперимента использовали 4-5 животных, от каждого животного анализировали по 100 метафаз.

<h4″>РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕЦитогенетический анализ клеток костного мозга, выполненный после однократного и пятидневного введения БЭС (150 мг/кг) самцам и самкам мышей и после его однократного введения самцам в дозе 1500 мг/кг, не выявил мутагенной активности экстракта. Количества клеток с хромосомными аберрациями в экспериментальных сериях исследования практически не отличались от значений, установленных у контрольных животных.

В таблице №1 представлены результаты, характеризующие влияние экстракта бересты (БЭС) на цитогенетические эффекты диоксидина (ДН) и циклофосфамида (ЦФ), применяемых из расчета 200 и 20 мг/кг, соответственно.

Однократное введение ДН в дозе 200 мг/кг привело к увеличению клеток с хромосомными аберрациями до значения 10.2±1.4%, что статистически достоверно выше значения контроля (1.6±0.6%).

После введения комбинации БЭС в дозе 50 мг/кг и ДН зафиксировано 4.8±1.0% аберрантных метафаз. Полученное значение статистически достоверно отличается от значения позитивного контроля и соответствует 53% снижению эффекта ДН. При применении БЭС в дозе 150 мг/кг антимутагенный эффект последнего возрос и составил 61%: зарегистрировано 4.0±0.9% поврежденных метафаз. Дальнейшее увеличение дозы БЭС до 450 мг/кг привело к снижению антимутагенного эффекта, который составил 33%.

Антимутагенные эффекты БЭС были далее подтверждены при использовании в качестве модельного мутагена ЦФ (таблица №1).

При применении БЭС в дозах 50 и 150 мг/кг зарегистрирован одинаковый антимутагенный эффект: снижение повреждающего действия мутагена в обоих случаях составило 60% (уровень хромосомных аберраций 3.5±0.9% против 8.8±1.4% в позитивном контроле). При дальнейшем увеличении БЭС до 450 мг/кг антимутагенный эффект не выявлен: полученный показатель – 6.4±1.1% аберрантных метафаз не отличался статистически достоверно от значения позитивного контроля.

В следующей серии экспериментов, результаты которых представлены в таблице №2, исследовалось влияние 5-дневной предобработки БЭС на проявление мутагенных эффектов ДН.

Антимутагенные эффекты БЭС по сравнению с однократным введением возросли. При использовании в дозе 50 мг/кг наблюдалось 49% снижение повреждающего действия мутагена. С увеличением вводимой дозы до 150 мг/кг защитный эффект БЭС возрос и составил 63%. При применении в дозе 450 мг/кг зарегистрирован максимальный антимутагенный эффект – полное подавление повреждающего действия мутагена: полученный показатель- 2.6±0.7% аберрантных метафаз не отличается статистически от значения спонтанного уровня мутирования (1.6±0.6%).

Антимутагенные эффекты БЭС при 5-ти дневной предобработке, по сравнению с однократным введением, возросли и при использовании в качестве мутагена ЦФ (таблица №2).

После введения ЦФ животным, обработанным БЭС в дозе 50 мг/кг, зарегистрировано 5.5±1.1% аберрантных метафаз, что соответствует 54% снижению цитогенетических эффектов мутагена. С увеличением дозы антимутагенный эффект БЭС возрос и составил 65%: 4.2±0.9% аберрантных метафаз против 12.0±1.5% в позитивном контроле. В отличие от однократного введения, БЭС проявил антимутагенный эффект и в дозе 450 мг/кг. Полученный показатель, 4.4±0.9% поврежденных клеток соответствовал 63% редукции эффектов мутагена.

В следующей серии экспериментов исследовали влияние БЭС на мутагенные эффекты ДН и ЦФ в условиях 5-ти дневного совместного введения. Полученные результаты представлены в таблице №3.

После пятидневной обработки животных ДН в дозе 200 мг/кг хромосомные аберрации зарегистрированы в 11.6±1.4% исследованных метафаз. После совместного применения БЭС в дозе 50 мг/кг и ДН выявлено 6.6±1.2% поврежденных клеток, что соответствует 43% снижению эффектов мутагена. Результат, полученный после совместного применения мутагена и БЭС в дозах 150 и 450 мг/кг составил, соответственно, 4.8±1.1% и 5.8±1.0% аберрантных метафаз. Попарное сопоставление зарегистрированных результатов с данными позитивного контроля выявило статистически достоверные различия, при этом в дозе 150 мг/кг антимутагенный эффект составил 59%, а дозе 450 мг/кг – 50%.

При использовании ЦФ антимутагенный эффект БЭС выявлен во всех исследованных дозах. После совместного введения БЭС в дозе 50 мг/кг и мутагена, зарегистрировано 3.8±0.7% аберрантных метафаз, что соответствует 54% снижению эффектов ЦФ. При применении БЭС в более высоких дозах 150 и 450 мг/кг антимутагенные последнего оказались сходными. Полученные показатели 5.0±1.0 и 5.2±1.0% аберрантных метафаз, соответствовали 40 и 38% редукции повреждающего действия мутагена.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о наличии у БЭС антимутагенной активности. Данное наблюдение согласуется с данными, указывающими на антимутагенные свойства бетулиновой кислоты и лупеола [7,8].

По совокупности полученных данных антимутагенные эффекты БЭС наиболее выражены в условиях предварительного многодневного введения и при его использовании в дозе 150 мг/кг. Сравнительный анализ антимутагенного действия по отношению повреждающему действию использованных мутагенов показывает, что БЭС наиболее эффективен в случае применения в качестве модельного мутагена ДН.

Экстракты бересты, а также бетулин (74 % в изучаемом образце), лупеол, бетулиновая кислота, входящие в состав БЭС, обладают выраженной антиоксидантной активностью [13]. В свою очередь, ДН, эффект которого эффективно подавляется БЭС, является мутагеном прооксидантного типа действия [6]. Следовательно, антимутагенное действие БЭС может быть объяснено его способностью к подавлению свободно-радикального окисления.

В реализации цитогенетического эффекта ЦФ принимают участие продукты ПОЛ [14], поэтому подавление эффекта этого мутагена также возможно объяснить наличием у БЭС антиоксидантной активности. Вместе с тем, ЦФ является непрямым мутагеном, основной механизм действия которого связан со способностью его метаболитов, главным образом акролеина, алкилировать молекулу ДНК [15]. Это позволяет предполагать, что защитное действие БЭС может быть также связано с подавлением активности цитохромов семейства Р450, участвующих в метаболизме ЦФ.

Можно полагать, что выше указанные механизмы не исчерпывают возможных путей реализации антимутагенного эффекта БЭС, поскольку в предварительных экспериментах была показана способность БЭС индуцировать продукцию интерферонов, которые, как известно, позитивно влияют на процессы репарации ДНК [6].

Предшествующий анализ [6] показал, что антимутагенный эффект соединений природного происхождения и их комплексов практически не превышает 50 %. При этом, наряду с позитивным антимутагенным эффектом они часто проявляют нежелательное комутагенное действие. БЭС выгодно отличается отсутствием комутагенных эффектов и эффективностью антимутагенного действия. Его защитный эффект в условиях однократного и предварительного введения в подавляющем большинстве случаев составляет не менее 60 %.

Таким образом, совокупность результатов, полученных в экспериментах на млекопитающих, позволяют заключить, что БЭС характеризуется выраженной антимутагенной активностью и не обладает нежелательными мутагенными и комутагенными свойствами.

</h4″>

Список литературы

1. Василенко Ю.К., Семенченко В.Ф., Фролова Л.М. и др. Фармакологические свойства тритерпеноидов коры березы// Эксперим. и клин. фармакология, 1993, т.56, №4, 53-55.

2. Recio M.C., Giner R.M. et al. Investigetions on the steroidal antiflammatory activity of triterpenoids from Diospyros leucomelas// Planta Medica, 1995, 61(1), 9-12.

3. Карачурина Л.Т., Сапожников Т.А., Зарудий Ф.С. и др. Исследование некоторых фармакологических свойств бисгемифталата бетулина// Эксперимент. и клин. фармакол., 2003, т. 66, №4, 56-59.

4. Akihisa T., Ogihara J., Kato J. Inhibitory effects of triterpenoids and sterols on human immunodeficiency virus-1 reverse transcriptase// Lipids, 2001, 36(5), 507-512.

5. Han S., Li Z. Antitumor effect of the extract of birch bark and its influence to the immune function// Zhong Yao Cai., 2000, 23(6), 343-345.

6. Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Мутагены: скрининг и фармакологическая профилактика воздействий // Москва, «Медицина», 1998, 326 с.

7. Salti G.I., Kichina J.V., Das Gupta T.K. et. al. Betulinic acid reduces ultraviolet-C-induced DNA breakage in congenital melanocytic naeval cells: evidence for a potential role as a chemopreventive agent// Melanoma Res, Apr 2001; 11(2): 99-104.

8. Guevara A.P., Amor E. and Russell G. Antimutagens from Plumeria acuminata Ait// Mutat. Res., Dec 1996; 361(2-3): 67-72.

9. «Сырье для производства биологически активных добавок к пище «Бересты экстракт сухой». Регистрационный номер СЭЗ 77.99.03.936.Б. 000201.02.04 от 16 февраля 2004 года.

10. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ./ Москва, 2000 г.

11. Бочков Н.П., Дурнев А.Д., Журков В.С. и др. Система поиска и изучения соединений с антимутагенными свойствами. (Методические рекомендации).// Хим.-фарм. жур., 1992, № 9-10, с. 42- 46.

12. Preston R.J., Dean B.J., Galloway S. at al. Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells// Mutat. Res., 1987, 189, 157-165.

13. Kahkonen M.P., Hopia A.I., Vuorela H.J., Rauha J.P., Pihlaja K., Kujala T.S. and Heinonen M. Antioxidant activity of plant extracts containing phenolic compounds// J Agric Food Chem, Oct 1999; 47(10): 3954-62.

14. Kanekal S., Kehrer J.P. Metabolism of cyclophosphamide by lypoxygenases.// Drug. Metab. Dispos.,1994, 22, 74-78.

15. Anderson D., Bishop J.B., Garner R.C. et al. Cyclophosphamide: review of its mutagenicity for an assessment of potential germ cell risk.// Mutat. Res., 1995, 330, 115-181.

16. Yamashita K., Lu H., et. al. Effects of three triterpenoids, lupeol, betulin and betulinic acid on the stimulus-indused superoxide generation and tyrosyl phosphorylation of proteins in human neutrophils// Clinica Chimica Acta, 2000, 325(1-2), 91-96.

Продукция компании “Березовый Мир”

Натуральные фитопрепараты на основе
Бетулиносодержащего экстракта бересты

100 % натуральный состав
сертификаты качества
27 патентов по использованию
медицинская доказательная эффективность
более 120 НИР
одобрено ассоциацией заслуженных врачей РФ
12 клинических испытаний

ООО «Берёзовый Мир»
119180 Москва, ул. Б. Полянка, д. 7/10, стр. 3
(Старомонетный пер. д.10, стр. 3)
Телефон: +7 800 234 87 79 (звонок по России бесплатный)
E-mail: info@birchworld.ru
с 09:00 до 18:00 по МСК в рабочие дни.

По вопросам сотрудничества:
E-mail: market@birchworld.ru

Мы рады Вас видеть и предоставить
необходимую консультацию