УДК 615.322.03:616.36-002-022:578.891J076.9

Н. Н. Носик, П. Г. Дерябин, Е. И. Исаева, Н. Г. Копдрашина, Л. А. Лаврухина, А. Н. Иноземцев,

Г. А. Преснова, Т. В. Тополева

Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, ООО «Березовый мир», Москва

Проведены исследования по изучению интерферониндуцирующей активности бересты экстракта сухого, содержащего бетулин, и его влияния на инфекцию, вызванную вирусом гепатита С (ВГС), в клетках. Все образцы препарата индуцировали высокий уровень синтеза интерферона как при внутрибрюшинном, так и при пероральном пути введения. Дозовая зависимость уровня синтеза интерферона указывает на пря­мую связь препарата с индукцией интерферона. Получены убедительные данные о способности препара­та снижать антигенную и инфекционную активность ВГС как в опытах in vitro, так и при инфекции, вызван­ной ВГС у мышей. Обнаружен профилактический эффект препарата при инфекции ВГС в культуре клеток и в организме ВГС-инфицированных мышей.

Ключевые слова: вирус гепатита С, инфекция, культура клеток, мыши, сухой экстракт бересты, индукция интерферона, противовирусное действие

The interferon-inducing activity of dry birch bark extract containing betulin and its effect on hepatitis С virus (HCV)-induced infection were studied in the cultured cells. All samples of the extract induced increased interferon (IFN) production when it was orally and intraperitoneally administered. The dose-dependence of the production of IFN showed a direct relation of the extract to interferon induction. There is strong evidence for that the extract can de­crease the antigenic and infective activity of HCV in both in vitro experiments and HCV-induced infection in mice. The preventive effect of the extract was found in both the HCV-infected cell cultures and the HCV-infected mice.

Key words: hepatitis С virus, infection, cell culture, mice, dry birch bark extract, interferon induction, antiviral effect

При очень ограниченном числе этиотропных противовирусных препаратов все большее внимание уделяется разработке и изучению средств, усили­вающих реакции неспецифического иммунитета. Новой и весьма перспективной группой препаратов для лечения вирусных инфекций, в том числе ви­русного гепатита С, являются индукторы интерфе­рона (ИФН), представляющие собой разнородную группу высоко- и низкомолекулярных природных и синтетических соединений, обладющих способно­стью индуцировать синтез ИФН. Как правило, эти препараты обладают антивирусной, антитумороген-ной и иммуномодулирующей активностью.

Вирус гепатита С (ВГС) относится к семейству Flaviviridae и является этиологическим агентом ге­патита С [5]. Острая ВГС-инфекция сопровожда­ется последующей персистирующей репликацией вируса примерно в 85—90% случаев. В результате расширяется спектр хронических заболеваний пе­чени, включая хронический гепатит, цирроз и ге-патоцеллюлярную карциному [5]. В настоящее вре­мя остро стоит вопрос поиска альтернативных пу­тей терапии ВГС-инфекции, поскольку почти единственным препаратом выбора для лечения ВГС-инфекции является а-ИФН [5].

С этой целью впервые в мире нами были созданы экспериментальные модели высокопродуктивной инфекции, вызванной ВГС, в культурах клеток и в организме животных. Из сывороток крови больных выделяли и идентифицировали цитопато-генные варианты ВГС, способные реплицироваться в организме мышей [1—4]. Тем самым была открыта перспектива проведения доклинических ис-пытаний антивирусного действия препаратов в отношении ВГС-инфекции. Производимый в на-стоящее время фирмой «Березовый мир» препарат растительного происхождения бересты экстракт сухой, содержащий тритерпеновые соединения, главным компонентом которых является пента-циклический тритерпеновый спирт ряда лупана бетулин с содержанием его в экстракте не менее 70%, обладает выраженными противовоспалительными и антитуморогенными свойствами [6—8]. Мы сделали предположение о способности экстракта индуцировать синтез ИФН, что требовало подтверждения, а также исследовали его воздействие на экспериментальную инфекцию, вызванную ВГС in vitro и in vivo.

Материалы и методы

Культура клеток. Использовали чувствительные к цитопатогенному действию ВГС культуры клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ). Культуры клеток СПЭВ выращивали на среде 199 с добавлением сы­воротки крупного рогатого скота (10%) и антибио­тиков. Для изучения противовирусной активности экстракта, содержащего бетулин, его в различных концентрациях вносили в культуры клеток СПЭВ за 24 ч до заражения клеток ВГС, в момент зара­жения и через 24 ч после заражения вирусом кле­ток. На 4-й день после заражения отбирали пробы среды и титровали вирус на культурах клеток СПЭВ. Результаты учитывали на 7-й день, когда в контрольных культурах развивались максимальные явления вирусиндуцированной гибели клеток, а пезаражспныс клетки СПЭВ оставались интактны-ми. Перевиваемую линию фибробластов мышей L929 получали из лаборатории культуры тканей Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН и использовали для определения уровня ИФН биологическим методом.

Животные. В исследовании использовали белых беспородных мышей массой 15—20 г, на которых изучали как интерферониндуцирующие свойства, так и после заражения ВГС антивирусное действие препарата. Материал, содержащий ВГС, вводили животным внутрибрюшинно. Часть животных со­ставили контрольную группу. На 9-й день после за­ражения мышам однократно перорально в течение 4 дней вводили суспензию экстракта, содержащего бетулин (50, 100 и 150 мг) на физиологическом рас­творе с 1% твина-80 в объеме 50 мкл. На 28-й день после заражения животных ВГС и на 11-й день по­сле последнего введения препарата животных вскрывали, извлекали печень, головной мозг, бра­ли кровь, готовили пробы гомогенатов органов и сыворотки крови для определения антигенов ВГС в реакции гемагглютинации (РГА) и инфекцион­ной активности ВГС. С целью изучения профилак­тического действия экстракта его в тех же дозах вводили разным группам мышей перорально в те­чение 4 дней. Через 2 дня после 4-го введения мы­шей заражали ВГС внутрибрюшинно. Через 7 дней после заражения от животных брали пробы тех же органов и тканей для исследования.

Вирусы. В исследованиях использовали цитопато-генный вариант ВГС, штамм D-1, выделенный из сы­воротки крови больной хроническим вирусным гепа­титом С, идентифицированный как генотип 1в ВГС [5]. Вирус энцефаломиокардита мышей использовали в качестве тест-вируса для определения титра ИФН.

Таблица I

Интерферониндуцирующая активность бересты экстракт сухого, содержащего бетулин, при внутрибрюшинном введении

Интерферониндуцирующая активность препарата БЕТУЛИН при внутрибрюшинном введении

Препарат	Доза, мг\кг	Уровень интерферона, ед\мл
		5 часов	24 часа	48 часов
Бетулин 72%	25,0	8	64	32
	50,0	8	256	256
Ридостин	7,5	128	256	256

Уровень ИФН в сыворотке крови мышей после перорального введения препарата с содержанием бетулина 72% (в) и 98% (б).

По осям ординат — титр ИФН (в ед/мл); по осям абсцисс — время (в ч). /-50 мг/кл; Я- 100 мг/кг; ///- 150 мг/кг

Препараты. С целью оценки противовирусного и интерферониндуцирующего действия исследова­ли 3 образца экстракта бересты: препарат № 1 (со­держание бетулина в экстракте 72% по данным вы­сокоэффективной жидкостной хроматографии — ВЭЖХ) вводили внутрибрюшинно; препарат № 22 (с содержанием бетулина 72% по ВЭЖХ) и препа­рат № 98 (с содержанием бетулина 98% по ВЭЖХ) — перорально. Исследуемые вещества растворяли в 1,0% растворе твина-80. Препарат № 1 вводили од­нократно внутрибрюшинно в течение 4 дней в до­зах 25,0 и 50,0 на 1 кг массы тела, препараты № 22 и 98 — однократно перорально в течение 4 дней в дозах 50,0, 100,0 и 150,0 мг/кг. Ридостин — индук­тор ИФН, представляющий собой дсРНК киллер-ного штамма дрожжей S. cerevisea, вводили одно­кратно внутрибрюшинно в дозе 7,5 мг/кг, исполь­зовали в качестве референс-индуктора ИФН.

Определение уровня ИФН. Уровень ИФН в пери­ферической крови определяли через 5, 24, 48 и 72 ч после однократного введения препарата. Опреде­ление уровня ИФН проводили биологическим ме­тодом по защите культуры клеток мышиных фиб-робластов L929 от 100 ЦПД₅₀ вируса энцефаломио-кардита мышей. За титр ИФН принимали величи­ну, обратную конечному разведению сыворотки, при котором наблюдали защиту 50% клеток от ци-_: тодеструктивного действия 100 ЦПД₅₀ тест-вируса.

Результаты и обсуждение

Введенный внутрибрюшинно препарат № 1 (со­держание бетулина 72%) индуцировал образование ИФН, который определялся в крови мышей через 24 ч после введения. Полученные результаты при­ведены в табл. 1. Отмечена дозовая зависимость уровня ИФН (64 ед/мл при дозе 25,0 мг/кг к 256 ед/мл при дозе 50,0 мг/кг).

Таблица 2

ПРОТИВОВИРУСНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПРЕПАРАТА БЕТУЛИН 98 НА ИНФЕКЦИЮ, ВЫЗВАННУЮ ВИРУСОМ ГЕПАТИТА С В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК СПЭВ.

Разведения препарата Бетулин	Титры ВГС в пробах среды, отобранных на 4-й день после заражения культур клеток СПЭВ (lg ТЦД50
	Препарат сразу после заражения	Через 24 часа после заражения	За 24 часа до заражения клеток
1:10	3,3	5.5.	2,5
1:20	1,3	5,5.	3,4
1:40	5,,0	4,6	3,2
1:80	4,8	5,0	3,3
Без препарата (контроль)	5,5.	5,5	5,4

Введение препаратов экстракта бересты перо-рально также индуцировало синтез ИФН у мышей, уровень которого достигал своего пика к 48 ч после введения. При применении препарата № 22, со­держащего 72% бетулина, отмечали четкую дозо-вую зависимость уровня ИФН, максимальный титр которого, равный 640 ед/мл, наблюдали через 48 ч при дозе в 150,0 мг/кг (см. рисунок, а).

При применении препарата № 98 с содержани­ем 98% бетулина также наблюдали высокий уро­вень ИФН с максимумом через 48 ч. Однако четкой дозовой зависимости не отмечали, все исследуемые дозы препарата индуцировали одинаково высокий уровень синтеза ИФН (см. рисунок, б).

Полученные данные легли в основу проведения доклинических испытаний противовирусной актив­ности препарата, содержащего 98% бетулина, при ин­фекции, вызванной ВГС, в культурах клеток СПЭВ.

Как видно из данных табл. 2, максимальная актив­ность бетулина была зарегистрирована при внесении его в разведении 1:20 в культуру клеток СПЭВ сразу же после заражения клеток ВГС. В этом случае титры ВГС в пробах среды, отобранных на 4-й день после заражения вирусом, снижались на 4,2 lg. Препарат не оказывал заметного влияния на снижение титра ВГС, когда его вносили через 24 ч после заражения клеток вирусом. Наиболее стабильное проявление антиви­русных свойств бетулина было отмечено при его про­филактическом применении, т. е. за 24 ч до зараже­ния клеток ВГС. Титры вируса, содержащиеся в про­бах среды, отобранной из зараженных культур клеток СПЭВ, в этом случае стабильно снижались под влия­нием разных разведений вносимого препарата на 2,1-2,9 1_ёТЦЦ₅₀.

Представляло интерес изучить способность экс­тракта, содержащего бетулин, подавлять инфек­цию, вызванную ВГС, у мышей. В табл. 3 представ­лены данные этих исследований. В частности, был выявлен противовирусный эффект бересты экс­тракта сухого у ВГС-инфицированных мышей на 28-й день после заражения животных и на 11-й день после последнего введения препарата. Наи­больший эффект наблюдался в период, когда для лечения использовали дозу 50 мг/кг. В этом случае в сыворотке крови животных титры вируса снижа­лись в среднем на 1,9 lg, в печени — на 2,9 lg, в го­ловном мозге — на 2,4 lg. Четырехкратное введение препарата в дозе 100 мг приводило к менее суще­ственному уменьшению титра ВГС (см. табл. 3).

Данные об интерферониндуцирующем дейст­вии экстракта бересты, а также об антивирусных свойствах препарата при его профилактическом применении в опытах in vitro позволили провести исследования по оценке профилактического дейст­вия препарата при ВГС-инфекции у мышей.

Как видно из данных табл. 4, профилактическое применение препарата, как правило, приводило к снижению показателей инфекции, вызванной ВГС, в организме инфицированных мышей. В ча­стности, применение препарата в дозе 50 мг на 1 кг

Таблица № 3

Действие экстракта бересты, содержащего бетулин, на 28-й день после заражения животных ВГС и на 11-й день после последнего введения препарата.

Группы мышей, получавших бетулин в дозе (мг /кг в 50 мкл)	Показатели ВГС инфекции
	в сыворотке крови		печень		головной мозг
	РГА	lgТЦД50/20мкл	РГА	lgТЦД50/20мкл	РГА	lgТЦД50/20мкл
50	120	5,2± 0,4	160	3,2± 0,1	400	3,4± 1,0
100	80	5,5. ± 0,6	110	5,3± 0,1	240	4,3± 0,2
150	100	5,5 ± 0,5	200	6,5 ± 0,2	270	4,2 ± 0,1
Без препарата	200	7,1± 0,1	480	6,1± 0,1	480	5,8± 0,5
Незараженная мышь	25	0	50	0	50	0

Таблица № 4

Профилактическое действие экстракта бересты, содержащего бетулин, на ВГС инфекцию у мышей.

Группы мышей, получавших бетулин в дозе (мг /кг в 50 мкл)	Показатели ВГС инфекции
	в сыворотке крови		печень		головной мозг
	РГА	lgТЦД50/20мкл	РГА	lgТЦД50/20мкл	РГА	lgТЦД50/20мкл
50	1: 6,4	4,0± 0,2	1:220	3,0± 0,3	1:120	4,2± 0,1
100	1:8	4,5. ± 0,1	1:450	3,7± 0,3	1:280	4,8± 0
150	1:58	5,5 ± 0,1	1:600	4,5 ± 0,3	1:420	7,2 ± 0,1
Без препарата	1:109	6,4± 0,2	1:850	4,6± 0,6	1:480	6,15± 0,5
Незараженная мышь	0	0	1:50	0	1:50	0

массы тела привело к 18-кратному снижению ан-тигенной активности вируса, а инфекционные титра ВГС в сыворотке крови животных в среднем снижались на 2,4 lg. Профилактическое применение препарата в дозе 100 мг на 1 кг массы животных приводило к 13-кратному снижению содержания антигенов ВГС в крови, инфекционные титры ВГС снижались при этом почти в 10 раз. В случае использования дозы препарата, равной 150 мг на 1 кг массы тела, снижение показателей ВГС-инфекции у животных было незначительным.

Обнаружено снижение антигенной активности ВГС в печени мышей, получавших профилактиче­скую дозу препарата в дозе 50 и 100 мг на 1 кг массы. Различия в группе мышей, получавших 150 мг препа­рата па 1 кг массы, и у инфицированных ВГС живот­ных контрольной группы были несущественны. Не получено заметных различий в этих группах живот­ных и по показателю инфекционной активности ВГС в печени. Однако в группах мышей, получавших пре­парат в дозах 50 и 100 мг на 1 кг массы, инфекцион­ные титры вируса в среднем снижались на 1,6 и 0,9 lg.

Профилактическое применение (50 мг/кг) пре­парата бетулин приводило почти к 100-кратному снижению инфекционной активности ВГС и 4-кратному снижению титра антигенов ВГС в тка­нях головного мозга мышей. В меньшей степени препарат действовал, когда ежедневная доза его со­ставляла 100 мг на 1 кг массы. Профилактическое применение препарата в дозе 150 мг на 1 кг массы не давало положительного эффекта.

Таким образом, все образцы бересты экстракта сухого индуцировали высокий уровень синтеза ИФН как при внутрибрюшинном, так и при пероральном пути введения. Дозовая зависимость уров­ня ИФН указывает на прямую связь препарата с индукцией ИФН. Отсутствие четкой дозовой зави­симости при максимальном содержании бетулина в препарата может указывать на достижение насыщенности в соотношении индуктор—рецепторы ИФН. Важным свойством экстракта бересты явля­ется его способность индуцировать синтез ИФН при пероральном пути введения.

Получены убедительные данные о способности препарата снижать антигенную и инфекционную активность ВГС как в опытах in vitro в культурах клеток СПЭВ, инфицированных цитопатогенным вариантом ВГС, так и при инфекции, вызванной ВГС, у мышей массой 18—20 г. Обнаружен профи­лактический эффект препарата при ВГС-инфек­ции и в культурах клеток, и в организме инфици­рованных ВГС животных.

ЛИТЕРАТУРА

1. Дерябин П. Г., Исаева Е. И., Вязов С. О., Львов Д. К.Летальная
   инфекция новорожденных мышей, вызванная вирусом гепа­
   тита С // Вопр. вирусол. — 1997. — № 6. — С. 253—259.
2. Дерябин П. Г., Исаева Е. И., Вязов С. О.и др. Хроническая
   инфекция культур клеток почки эмбрионов свиньи, вы­
   званная вирусом гепатита С // Вопр. вирусол.’— 1997. —
   № 6. — С. 259-263.
3. Дерябин П. Г., Львов Д. К.Высокопродуктивный вариант,
   вируса гепатита С. Выделение, характеристика, идентифи­
   кация //Докл. АН Рос. Федерации. — 1998. — Т. 358, № 5.
   -С. 688-691.
4. Дерябин П. Г., Львов Д. К., Исаева Е. И., Вязов С. О.Штамм
   Virus hepatitis С, Д-1 для приготовления диагностических
   и профилактических препаратов. Российский пат. на изо­
   бретение № 2130967, 1999 г. Приоритет от 07.10.97.
5. Львов Д. К., Дерябин П. Г.Географическое распростране­
   ние вируса гепатита С и его генотипов // Вопр. вирусол.
   — 1997. -№ 5. -С. 196-199.
6. ManezS., Recio M.С, GinerR. M., RiosJ. L. Effect of selected
   triterpenoids on chronic dermal inflammation // Eur. J. Phar­
   macol. — 1997. — Vol. 334, N 1. — P. 103-105.
7. ZdzisiuskaВ., Rzeski W., Paduch R. et al. Differential effect of
   betulin and betulinic acid on cytokine production in human
   whole blood cell culture // Pol. J. Pharmacol. — 2003. —
   Vol. 55, N 20. — P. 235-238.
8. Zuco V., Supino R., Righetti S.С et al. Selective cytotoxicity of
   betulinic acid on tumor cell lines, but not on normal cells //
   Cancer Lett. — 2002. — Vol. 175, N 1. — P. 17-25.

Поступила 10.08.04