Стрелкова Л.Б.*, Минеева М.Ф.*, Тополева Т.В.**,
* НИЦ биомедицинских технологий ВИЛАР, ( НИЦ БМТ ВИЛАР), 123056 , Москва , ул. Красина .д.2. тел. 294-11-93.
** ООО «Березовый мир», г. Москва 119180, Москва, Б.Полянка д.7/10, стр3,
тел. (495) 785 – 92 – 92. E-mail info@birchworld.ru

Effect of the Dry Birch Bark Extract on cytochrome P₄₅₀ and on microsomal membranes of rats, liver

Resume
Strelkova L.B.*, Mineeva M.F.*, Topoleva T.V.**.
*The Research center of biomedical technologies VILAR, Moscow
** “Birch world” company

There was established that Birch dry extract induce significantly raising of cytochrome P₄₅₀ monooxygenase, especially of hydroxylase activity in microsomes from intact rat liver in vitro. Рosseses membranotropic and membranoprotective properties: reduces assotiation of fluorescent MBA zond with intact microsomal membranes in vitro . Thus, Birch dry extract can activate cytochrome P₄₅₀, especially its hydroxylating activity in vitro. It is possible that membranotropic properties of Betula dry extract takes part in its activative action on the enzymatic activity of cytochrom P₄₅₀.

«Бересты экстракт сухой» (БЭС), полученный из верхнего слоя коры берёзы по оригинальной технологии ООО «Березовый мир», обладает широким спектром фармакологического действия, обусловленной суммой тритерпеновых соединений, основным из которых является бетулин (бетулинол).

Настоящая работа посвящена изучению важного аспекта гепатопротекторного действия БЭС, а именно, детоксицирующей активности образцов БЭС, показателем которой служило их влияние на ферменты биотрансформации – цитохром Р₄₅₀ (in vitro и при системном введении животным) и глутатионтрансферазу (при системном введении животным с экспериментальным гепатитом). В связи с тем, что цитохром Р ₄₅₀ является интегральным белком биологических мембран и его монооксигеназная активность зависит от их состояния, изучали мембранотропное действие серийного образца БЭС с помощью незаряженного флюоресцентного зонда МБА (3-метоксибензантрона).

Материалы и методы:

Объектом исследования служили микросомы, выделенные из печени интактных животных, а также животных с экспериментальным гепатитом токсического происхождения, не получавших (контроль) и получавших БЭС.

Микросомальную фракцию печени получали методом дифференциального центрифугирования. Содержание белка в суспензии микросом определяли по методу Лоури и соавторов в присутствии 0,1% дезоксихолата натрия. Содержание цитохрома Р₄₅₀ определяли спектрофотометрически, по методу Омура и Сато, регистрируя дифференциальные спектры поглощения восстановленного дитионитом натрия СО-комплекса на дифференциальном спектрофотометре Shimadzu MPS-2000 (Япония) . Скорость деметилазной и гидроксилазной реакций цитохрома Р ₄₅₀ определяли спектрофотометрически, в кинетическом режиме, на спектрофотометре Shimadzu MPF-2000 по уменьшению поглощения при 340 нм за счет окисления НАДФН в присутствии субстратов цитохрома Р₄₅₀ – диметиланилина (ДМА) – 3 мкМ) или анилина –3 мкМ. Концентрация микросом в пробе составляла 1 мг белка/мл. Буфер – 0,1 М К-фосфат рН 7,4. Образцы БЭС растворяли в ацетоне и добавляли в конечной концентрации 2 мкг, 0,2 мкг, 0,02 мкг на мл пробы.

Активность глютатионтрансферазы определяли измеряя прирост продуктов коньюгации спектрофотометрически при 340 нм.

При изучении мембранотропности применяли специфический незаряженный гидрофобный зонд МБА, растворенный в диметилформамиде в исходной концентрации 10 мкМ. Для определения связывания МБА с микросомальной мембраной in vitro определяли константу связывания (Кс) МБА с интактной микросомальной мембраной без добавления БЭС и в присутствии БЭС в пробе в конечных концентрациях 5 мкг/мл и 25 мкг/мл. Для определения связывания МБА с биомембраной суспензию микросом с содержанием белка 0,15 мг/мл титровали раствором МБА в диапазоне концентраций от 1 мкМ до 20 мкМ.

Результаты:

В интервале концентраций 0,02-0,2 мкг/мл пробы БЭС проявляет заметно выраженное активирующее влияние на гидроксилазную активность цитохрома Р_450. и обладает важным свойством – непосредственно активировать ключевой фермент биотрансформации – цитохром Р₄₅₀, играющий решающую роль в процессах детоксикации, протекающих в печени и являющихся важным аспектом гепатопротекторного действия. Молекулярный механизм обнаруженного эффекта не изучен, однако нельзя исключить связи активирующего действия компонентов БЭС на активность ферментов системы биотрансформации in vitro с мембранотропностью БЭС. В связи с этим изучалось влияние образца БЭС на на микросомальную мембрану с использованием флуоресцентного гидрофобного зонда МБА.

При увеличении концентрации БЭС в пробе от 1 до 25 мкг/мл интенсивность флуоресценции МБА снижается почти в 5 раз, что свидетельствует о взаимодействии БЭС с мембраной.

Установлено БЭС влияние на константу связывания зонда МБА с микросомальной мембраной. В этих экспериментах микросомальные мембраны (0,15 мг/мл) титровали зондом МБА до и после добавления БЭС (5 мкг/мл или 25 мкг/мл). Установлено изменение константы связывания (Кс) МБА с мембраной.

БЭС оказывает влияние на связывание МБА с мембраной. Рассчитанная из полученных данных константа связывания (Кс) зонда МБА с интактной мембраной составляла 0,135 мкМ^-1, в присутствии БЭС в концентрации 5 мкг/мл Кс возрастала в 1,7 раза и составляла 0, 235 мкМ^-1. При увеличении содержания БЭС в пробе до 25 мкм/мл Кс снижалась до 0,200 мкМ^{-1 .}

Выводы:

Приведенные результаты показывают, что БЭС обладает сродством к микросомальной мембране, что проявляется в изменении степени связывания зонда МБА с полярной областью мембраны, сформированной, в том числе, карбонильными группами фосфолипидов. Таким образом, в экспериментах in vitro установлено, что БЭС оказывает непосредственное активирующее влияние на монооксигеназную активность цитохрома Р₄₅₀. В молекулярном механизме этого эффекта определенную роль может играть выраженное связывание БЭС с микросомальной мембраной.